氨基酸测定仪的工作原理说明

　　氨基酸测定仪作为分析蛋白质和游离氨基酸组成的“金标准”工具，具有显著的优势，但也存在一些局限性。仪器主要基于离子交换色谱法结合柱后衍生化技术。接下来介绍氨基酸测定仪的核心工作原理：
　　1.样品前处理：
　　蛋白质样品：需要先经过酸水解（通常用6M盐酸，110°C，24小时）将蛋白质分解成单个氨基酸。色氨酸和部分含硫氨基酸在此过程中可能被破坏。
　　游离氨基酸样品（如血浆、细胞培养液）：通常经过脱蛋白、过滤等简单处理即可。
　　处理后的样品需进行适当的稀释和缓冲液平衡。
　　2.分离-离子交换色谱：
　　样品被注入到一个装有强酸性阳离子交换树脂的色谱柱中。
　　在高温（通常50-60°C）下，通过梯度洗脱（使用不同pH值和离子强度的缓冲液，如柠檬酸钠或锂盐缓冲液）。
　　不同的氨基酸因其侧链基团的酸碱性（pKa值）和疏水性不同，与树脂的结合力也不同。随着缓冲液条件的变化，它们会以不同的速度从色谱柱中被“洗脱”出来，从而实现分离。
　　3.衍生化-柱后反应：
　　从色谱柱流出的、无色的氨基酸组分，与一种衍生化试剂在高温反应器中混合发生化学反应。
　　常用的试剂是茚三酮（Ninhydrin）：与大多数α-氨基酸反应生成紫色的Ruhemann's紫（λmax≈570 nm），与亚氨基酸（如脯氨酸、羟脯氨酸）反应生成黄色化合物（λmax≈440 nm）。
　　OPA（邻苯二甲醛）：与伯胺（包括氨基酸）在巯基乙醇存在下快速反应生成强荧光物质（激发/发射波长约340/455 nm），灵敏度更高，常用于快速分析或微量样品。
　　4.检测：
　　分光光度检测（茚三酮法）：检测反应后溶液在570nm（紫色）和440nm（黄色）的吸光度。
　　荧光检测（OPA法）：检测反应产物的荧光强度。
　　检测器将光信号转换为电信号，形成随时间变化的色谱峰。
　　5.数据处理：
　　色谱峰的保留时间用于定性（确定是哪种氨基酸）。
　　色谱峰的峰面积（或峰高）与氨基酸的浓度成正比，通过与已知浓度的标准品比较进行定量。