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类别:解决方案 出处:维库仪器仪表网 发布于:2018-07-27 17:38:19 | 5235 次阅读
因为含维生素A原料中常常混有许多杂质,包括异构体,氧化降解产物,合成中间体,副产物等有关物质,且含有稀释用油,这些杂质在紫外区也有吸收,导致在维生素A吸收波长处测得的吸光度并不是维生素A独有的吸收,为了消除其他物质引起的误差,所以采用三点校正法。
三点波长的选择原则:一点选在维生素A的吸收波长处,其他的两点各在这一波长两侧选一点。这两点有两种选择方法,种是等波长差法,即吸收波长为328nm,左侧一点为316nm,右侧一点为340nm.这是10版药典规定测定维生素A醋酸酯的方法。第二种方法是等吸收比法,即左右两波长处的吸光度相等等于吸收波长处吸光度的七分之六。10版药典规定测定维生素A醇时用此方法。
1.原理
维生素A的异丙醇溶液在325 nm波长下有吸收峰,其吸光度与维生素A的含量成正比。本法的灵敏度较比色法高,可测定维生素A含量低于5?g/g的样品。主要缺点是在维生素A吸收波长325 nm附近许多其他化合物也有吸收,干扰测定,故本法适用于透明鱼油,维生素A的浓缩物等纯度较高的样品。对于一般样品,测定前必须先将脂肪抽提出来进行皂化,萃取其不皂化部分,再经柱层析除去干扰物。
2.仪器
紫外分光光度计; UV-1100;UV-1200。
3.试剂
①异丙醇。
②维生素A标准溶液:称取1 g相当于50 000国际单位维生素A的浓鱼肝油0.1000 g,加异丙醇溶解,定容至125 mL。此溶液1 mL相当于40国际单位(即40 IU.mL-1)。
4.测定步骤
①标准曲线绘制:分别取维生素A标准溶液(40 IU·mL-1)O.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL,于10 mL棕色容量瓶中,用异丙醇定容。以空白液调仪器零点,于紫外分光光度计上在325 nm波长下分别测定吸光度,绘制标准曲线。
②样品测定:称取适量样品,按照三氯化锑比色法进行皂化、提取、洗涤、浓缩、蒸发醚层后,迅速用异丙醇溶解并移人50 mL容量瓶中,用异丙醇定容,于紫外分光光度计325nm处测定其吸光度,从标准曲线上查出相当的维生素A含量。
5.计算X=[(c*V)/m]*100
式中:
X——样品维生素A的含量,IU·(100 g) -1;
c——由标准曲线查得的维生素A含量,IU·mL-1;
V——样品的异丙醇溶液体积,mL;
m——样品质量,g。
为何不直接以紫外可见分光光度法测定维生素A的含量,而要采用较为繁琐的三点校正法
牛胸腺DNA 钠盐溶液(pH = 7.0)ε(ρ)= 6 600,DNA 含磷量9.2%,含1μg/mL DNA 钠盐溶液光密度0.020.RNA 溶液(pH = 7.0)ε(ρ)= 7 700~7 800,RNA 含磷量9.5%,含1μg /mL RNA 溶液光密度0.022~0.024.采用紫外光光度测定核酸含量,通规定:260nm 波,浓度1μg/mL DNA 溶液其光密度0.020,浓度1μg/mL RNA 溶液其光密度0.024.,测定未知浓度DNA (RNA)溶液光密度OD260nm,即计算测其核酸含量.该简单、快速、灵敏度高,核酸3μg/mL 含量即测.于含微量蛋白质核苷酸等吸收紫外光物质核酸品,测定误差较,若品内混杂量述吸收紫外光物质,测定误差较,应设事先除.
由于降解或水解作用,核酸光密度增高约40%,众所周知增色效应(hyperchromic effect).核酸,氢键π-键相互作用改变碱基共振行.,核酸光密度低于构核苷酸光密度,该现象称减色效应(hypochromic effect).
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