酶标仪的使用方法

　　酶标仪其基本功能不外乎一个比色测定，所不同的是在测定波长范围、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量测定软件功能等方面的差异，当然全自动酶免疫分析系统还具有自动洗板、温育、加样等功能。在临床实验室实际工作中，实验人员在使用酶标仪进行测定操作时，有时难免会对酶标仪的一些性能指标产生迷惑，甚至对酶标仪的应用产生错误的理解。

　　一、测定波长

　　目前国内常见的ELISA试剂盒所使用的标记用酶均为辣根过氧化物酶(HRP)，底物通常为四甲基联苯胺(TMB)和邻苯二胺(OPD)，其在过氧化氢溶液的存在下，经HRP作用，分别氧化为2,2,-二氨基偶氮苯(DAB)和联苯醌。当pH值为5.0左右时，DAB在450nm波长处有吸收，当pH值降为L0时，吸收波长移至492nm,同时摩尔消光系数变大，显色加深，因而常用强酸如硫酸或盐酸终止反应。TMB的氧化产物联苯醌在波长450nm处有消光系数，如果HRP量少，H:O:和TMB过量时，则形成蓝色的阳离子根。降低pH,即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使用硫酸作为终止剂可使产物稳定90min。因此，450nm和492nm两个波长是目前ELISA测定常用的。酶标仪有单波长和双波长检测功能有时使用者不知在什么情况下使用单或双波长检测。所谓的“单波长”就是使用一种对显色具吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定；而“双波长”则除了用对显色具吸收的波长即450nm或492nm进行比色测定外，同时用对特异显色不敏感的波长如630nm进行测定，酶标仪打印出来的吸光度则为二者之差。630nm波长下得到的吸光度是非特异的，来自于板子上诸如指纹、灰尘、脏物等所致的吸收。因此，在ELISA比色测定中，使用双波长，且不必设空白孔。

　　二、测定的吸光度范围

　　酶标仪的吸光度测定范围在。0-2.5之间即可以满足ELISA的测定要求。早期的酶标仪可测定的吸光度一般在0-2.5之间，但现在基本上都做了拓宽，可达到3.5以上，并且能保持很好的精密度与线性。

　　三、光学系统

　　酶标仪的光学系统采用的是垂直光路多通道(通常为8或12通道，亦有单通道)检测，一般为硅光管或光导纤维，除测定通道外，有的酶标仪还有一个参比通道，每次测定可进行自我校准。酶标仪的光学系统功能如何，均可通过酶标仪测定的吸光度范围、线性度、精密度和准确度等体现出来。光学系统好的话，则上述指标也应较佳。测定的精密度与测定通道之间的均一性有直接关系。单通道可避免因通道不同所致的差异。

　　四、检测速度

　　酶标仪的检测速度是指其完成比色测定所需要的时间。检测速度快，有利于提高检测的精密度，即避免由于测定过程中，因测定时间不同所致的各微孔间吸光度间的差异。

　　五、震板功能

　　酶标仪的震板功能是指酶标仪在对ELISA板孔进行比色测定前对其进行振荡混匀，使板孔内颜色均一。目前市场上常见的酶标仪均有震板功能，所不同的是震板方式，有的可按上下、左右或旋转等方式及振荡幅度等任意调节。使用有震板功能的酶标仪，在进行ELISA测定显色反应完成加入终止剂后，可不必振荡混匀，直接放人酶标仪上测定即可。

　　六、温育功能

　　温育功能是指酶标仪本身能按要求自动地控制仪器内部的温度，使得ELISA测定中微孔板条的温育过程可在仪器内部完成，而无需再外配温箱。目前，只有少部分酶标仪具有此种功能。

　　七、软件功能

　　软件功能是指酶标仪所具有的对ELISA定性和定量测定及其他测定方式如酶标动力学、紫外和凝集等数据的统计分析并报告结果的功能。软件功能是中酶标仪的一个非常重要的功能。如果硬件方面区别不大，则软件就成为判定酶标仪优劣的惟一指标。对于用户来说，好的软件功能，对实际工作会有较大的帮助。ELISA定性测定，酶标仪如具有阳性判断值(cut-off)及其测定“灰区”(即指测定吸光度处于cut-off周围的一定区域，此区域内结果应为“可疑”)的统计计算功能，不但方便了实验室工作人员，而且在某些特定的情况下，有很高的实用价值。有研究表明，四参数方程能较好地反映免疫测定的剂量反应曲线，为适合于定量酶免疫测定的曲线拟合。因此，如目的是定量测定，则在酶标仪的软件功能中，要有这种曲线回归方程计算分析功能。其他诸如连点、直线等回归计算，则可根据酶标仪的应用目的而定，如兼用于微量生化测定，则此类回归计算就很有必要。

　　八、语言界面

　　通常进口的中酶标仪人机对话多采用英文。这对于某些基层实验室可能会存在语言方面的困难，从而难以限度地发挥酶标仪的作用。为解决这方面的问题，已有一些酶标仪采用了中文界面。这样就大大方便了广大基层实验室技术人员的使用。

　　综上所述，尽管酶标仪的发展极为快速，种类繁多，功能也不断加强，但其根本的功用是不变的，即比色测定。大凡比色测定，其基本要求就是在一定吸光度范围内要有好的测定准确性、线性和精密性。同样的吸光度范围，测定的准确性、线性和精密性越好则酶标仪亦越佳。